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《铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆》

来源:中国期刊网位置:农业科学时间:15-02-07 10:59

锌(Zn)是生物体中普遍存在的一种必需微量元素,对植物体的生长发育至关重要[1]。其作为300多种酶的辅因子不仅参与植物体的各种生理生化代谢途径,而且在维系细胞膜稳定性和调控基因表达方面也起重要作用[1-2]。适当增加体内锌含量可提高植物产量并改良品质,锌缺乏则会导致植物细胞光和生理、蛋白合成以及质膜系统等功能异化,严重影响植物的生长发育[3]。因此,控制锌离子在植物体内的生理平衡,对于维系植物体正常生理代谢是必须的。研究发现,许多膜转运蛋白基因家族都涉及植物中锌的吸收、转运和体内平衡,其中,锌铁调控转运蛋白[zinc-regulated transporters (ZRT), iron-regulated transporter (IRT)-like protein, ZIP]是介导锌转运的一类重要蛋白[4]。现已从拟南芥[5]、苜蓿[6]、菜豆[7]、玉米[8]、大麦[9]和水稻[10]等植物中鉴定了大量ZIP基因家族成员。绝大多数ZIP蛋白含8个跨膜区及相似的膜拓扑结构,C-和N-末端位于膜外,位于胞内的“可变区”与Zn2+的结合、转运密切相关[4]。除了转运Zn2+,ZIP蛋白还负责胞内Fe2+,Mn2+,Cd2+等2价阳离子的转运,同时,ZIP基因家族成员间表现出对不同离子的特异性和专一性[2,4]。可见,ZIP蛋白在维系植物细胞内部分金属阳离子稳态方面起关键调控作用。
 
  铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium多年生草本植物,药用部位为新鲜或干燥茎,具有益胃生津,滋阴清热,润肺止咳,明目强身等作用,是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种[11]。铁皮石斛主要含多糖、生物碱、氨基酸、菲类化合物和微量元素等有效成分,具有重要的药理活性[12]。铁皮石斛已在生物学、药理学等方面研究取得较大进展,但分子生物学研究相对匮乏[13-14],限制了对其遗传改良和资源开发。前期利用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术富集菌根真菌侵染铁皮石斛根的差异表达基因[15],分离到1条352 bp的EST,与水稻OsZIP8(GenBank注册号BAJ25746)一致性较高(75%),编码一段ZIP蛋白羧基端肽链。鉴于ZIP基因在植物细胞生理代谢中的重要作用,本研究运用RACE技术克隆DoZIP1基因,并进行生物信息学和表达分析,为进一步揭示该基因在铁皮石斛生长发育中的功能奠定基础。
 

  1材料与方法

 
  1.1样品野生铁皮石斛D. officinale植物材料采自云南西双版纳,取石斛根、茎、叶组织样品,液氮速冻后置-80 ℃保存备用。
 
  1.2RNA提取和cDNA合成按照EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab, China)操作说明制备各样品总RNA,NanoDropTM 2000分光光度计(Thermo Fisher, USA)分析RNA质量、纯度,琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Promega, USA)操作说明,逆转录合成cDNA第一链,-20 ℃保存备用。
 
  1.3RACE与RT-PCR验证根据原EST设计2对引物,按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clotech, Japan)说明书进行巢式5′-RACE扩增。5′-RACE引物为:R1 5′-ACTATGCAGTAATTTAAGCCCATTTGGC-3′,R2-nest 5′-ATTTAAGCCCATTT GGCTAAAAG-3′(下划线碱基反向互补为终止密码子)。用2 μg总RNA合成5′-RACE ready cDNA,稀释10倍,-20 ℃保存备用。
 
  以R1与UPM组合,使用Program 1程序进行第一轮5′-RACE。反应体系:10× Advantage 2 PCR buffer 2.5 μL,dNTPs (10 mmol・L-1)0.5 μL,R1(10 μmol・L-1)0.5 μL,UPM (10 μmol・L-1) 0.5 μL,5′-RACE ready cDNA 1.0 μL,50 × Advatange 2 Polymerase Mix (5 U・L-1) 0.5 μL,补ddH2O至25 μL。各取1.0 μL反应产物作为模板,以R2-nest与Nested Universal Primer A (NUP)组合,进行第2轮5′-RACE。PCR程序为:94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,32个循环;72 ℃ 7 min,4 ℃保温。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,TianGen胶回收试剂盒(TianGen, China)纯化目的条带,连接至pMD18-T vector (Takara, China),转化大肠杆菌JM109感受态细胞,随机挑选3个克隆并送上海生工测序。   1.4生物信息学分析使用一系列网络在线工具进行DoZIP1基因及编码蛋白的生物信息学分析。利用NCBI的BLASTx和ORF Finder分析cDNA序列;用InterProScan和PROSITE SCAN分析蛋白质结构域和基元;Protparam和SOPMA分析蛋白质理化性质和二级结构;ProtScale分析蛋白的亲水性/疏水性;SignalP 4.0预测信号肽;TMHMM预测蛋白跨膜域。PSORT进行亚细胞定位分析。用DNASTAR 6.0,MEGA 4.0分别进行DoZIP1蛋白的氨基酸序列比对和进化树构建分析。
 
  1.5实时定量PCR分析分别用2 μg根、茎、叶样品总RNA反转录合成cDNA,EF1a为内参基因[16],qPCR分析DoZIP1基因的组织表达模式。引物为qPCR-F (5′-CGGGCTTCATCCACATACT CC-3′)和qPCR-R(5′-AACTATTCCCACCTCCAACACC-3′)的扩增产物长347 bp。用ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems, USA)进行扩增。反应体系25 μL包括2× SYBRR Premix Ex TaqTM Master Mix (Takara, China) 12.5 μL,正反向引物(10 μmol・L-1) 0.5 μL,ROX 0.5 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 9 μL。每个反应重复3次,包括不加模板的对照,实验重复3次。PCR程序为95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s,40个循环,反应结束绘制溶解曲线。根据ABI PRISM 7500 SDS软件(Applied Biosystems, USA)生成的循环阈值(Cycle threshold, CT),用2-ΔΔCt法[17]计算相对表达量。
 

  2结果与分析

 
  2.1DoZIP1基因的克隆分析2次巢式5′-RACE扩增获得长度约为1.1 kb的目标条带(图1)。因为R2-nest下游引物跨原EST的终止密码子,该目标产物应该系基因全长。克隆、测序和拼接分析获得了一条1 100 bp的cDNA,BLASTx分析显示其与GenBank已注册的植物ZIP基因一致性为56%~64%。其包含的ORF长1 056 bp,5′-UTR长31 bp,3′-UTR长13 bp,起始密码子附近序列AAAATGA符合KOZAK规则[18],表明已成功获得基因全长,命名为DoZIP1,提交GenBank获得注册号KJ946203。
 
  1.5′RACE扩增产物; M .DL 2 000相对分子质量标准。
 
  2.2DoZIP1蛋白的理化特性推定的DoZIP1蛋白含Leu最多,为47个(13.4%),其次是Ala,Gly和Ile,均为33个(9.4%),其他氨基酸数目在6.0%~0.9%,如Phe为20个(5.7%),Thr为17个(4.8%),Trp仅3个,占0.9%。Protparam预测其分子式为C1727H2732N436O468S15,含351个氨基酸,等电点(pI)6.09,相对分子质量37.57 kDa,正电残基(Arg+Lys)21,负电残基(Asp+Glu)27,不稳定系数36.13,脂肪系数高达119.77,亲水性系数0.610。ProtScale分析结果显示,DoZIP1蛋白疏水性最大值为3.456,亲水性最高值为-3.211,且在较多位置上均表现出疏水性,说明其是1个疏水性蛋白质。
 
  2.3DoZIP1蛋白的二级结构、结构域和保守基序分析SOPMA预测结果显示(图2),DoZIP1蛋白二级结构共有α螺旋(alpha helix, 50.71%)178处,随机卷曲(random coil, 36.18%)127处,延伸链(extended strand, 11.11%)39处以及β转角(beta turn, 1.99%)7处;α螺旋和随机卷曲为二级结构的主要元件,分散于整个蛋白质中。
 
  InterProScan分析表明,DoZIP1蛋白含有锌铁调控转运相关蛋白结构域(42~348),以及1个典型的保守基序(HSVIIGLSLGA,209~219)。PROSITE SCAN分析表明DoZIP1蛋白含有数目不等的功能基元,包括2个N-糖基化位点(104~107,326~329)、3个蛋白激酶C磷酸化位点(42~44,225~227,287~289)、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(22~25,184~187)、8个N-肉豆蔻酰化位点(87~92,180~185,214~219,241~246,243~248,272~277,276~281,295~300)和1个酰胺化位点(34~37),这些基元可能对蛋白的结构和功能具有重要的作用。   2.4DoZIP1蛋白亚细胞定位、信号肽和跨膜域预测PSORT预测DoZIP1蛋白定位在质膜的可能性最高为64%,定位于高尔基体几率为46%,定位于内质网膜为37%,内质网腔为10%。SignalP4.1预测分析DoZIP1蛋白含1个信号肽(1~24),为分泌蛋白。TMHMM分析结果显示(图3),DoZIP1蛋白具有8个跨膜区(5~22,42~64,76~98,120~142,197~219,261~283,290~311,326~348),位于第4,5个跨膜域间的可变区处于胞内,说明该基因编码蛋白很可能为膜定位蛋白。
 
  2.5DoZIP1和其他植物ZIP蛋白的多序列对比运用DNAStar 5.0中的MegAlign程序对DoZIP1蛋白和已知植物ZIP蛋白进行多序列对比分析。DoZIP1与葡萄(Vitis vinifera, XP_002264621)、柑橘(Citrus sinensis, XP_006481378)、毛果杨(Populus trichocarpa, XP_002307860)、蓖麻(Ricinus communis, XP_002527722)和水稻(Oryza sativa, Q7XLD4)等植物ZIP蛋白的一致性分别为61.8%,61.5%,61.3%,60.4%,50.1%(图4)。
 
  2.6DoZIP1与拟南芥、水稻ZIP家族蛋白的进化关系下载具有代表性的拟南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa ZIP家族蛋白氨基酸序列,使用MEGA 4.0 软件邻接法(Neighbour-joining, NJ)构建系统进化树(图5)。结果显示,DoZIP1蛋白与ATIRT1,AtZIP8,OsZIP3,AtZIP10聚成一个分支,与OsZIP3,AtZIP10的亲缘关系较近。
 
  2.7基因表达模式分析分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总RNA,利用实时定量基因扩增荧光检测系统(QPCR)技术检测基因表达模式。DoZIP1基因在3种组织中为组成型表达,相对表达量有明显差异,转录本在根中相对表达量较高(图6),为茎中的4.19倍,叶中次之(1.12倍)。
 

  3讨论

 
  锌铁调控转运蛋白通过介导Zn2+,Fe2+,Mn2+,Cd2+等2价阳离子的转运,调节胞内离子稳态,在植物生长发育过程中起重要调控作用。关于植物ZIP基因的系统性研究主要来自拟南芥[5]、苜蓿[6]、菜豆[7]、玉米[8]、大麦[9]和水稻[10]等重要模式植物或者作物,尚未见到药用植物ZIP基因的相关报道。植物ZIP通常呈多基因家族,各成员之间协同作用控制着植物对微量元素的高效吸收和利用。铁皮石斛生于海拔约1 600 m的山地半阴湿的岩石上,喜温暖湿润气候和半阴半阳的特殊环境,生长缓慢,极难存活,野生资源濒危[13]。鉴定铁皮石斛ZIP家族基因并研究其生物学功能,揭示特殊生长环境下微量元素高效利用的生理机制,将为道地药材形成的分子机制和高产优质品系的培育提供理论依据。因此,本研究利用RACE技术分离到1个铁皮石斛锌铁调控转运蛋白编码基因DoZIP1,并分析了编码蛋白理化特性、结构域、跨膜域、亚细胞定位以及进化关系等生物信息学特征。
 
  DoZIP1与多种植物ZIP基因一致性较高,编码蛋白有ZIP家族的保守结构域和多个基序,其氨基酸数(351个)介于植物ZIP蛋白氨基酸数309~476[8],可变区亦富含结合金属离子的组氨酸残基,这些符合植物ZIP的序列特征[4]。DoZIP1蛋白包含信号肽和跨膜域,系膜蛋白,印证了PSORT的质膜定位分析,和其他植物ZIP蛋白的膜定位特性一致[2,4]。同一基因家族的不同成员一般包含相似序列和功能结构域,执行类似的生物学功能[19]。DoZIP1与OsZIP3,AtZIP10处于ZIP系统进化树的同一分支上、亲缘关系较近,OsZIP3受缺锌条件诱导参与水稻对锌的吸收[10],DoZIP1蛋白应该具有相类似的作用。植物对矿质元素的吸收主要在根中进行,细胞利用离子通道、转运子等蛋白通过质外体或共质体策略介导矿质元素的吸收、转运和分配,调控植物的生理适应和生长发育[6]。实时定量PCR分析结果显示DoZIP1基因在石斛根中表达丰度较高,因此推测该基因可能在石斛根中发挥转运微量元素的生理作用。当然,DoZIP1基因究竟在微量元素转运过程的怎样起作用,石斛ZIP基因家族其他成员与其功能有何差异,是否存在相互作用,这些有待于进一步深入研究。
 
  [参考文献]
 
  [1]Coleman J E. Zinc enzymes[J]. Curr Opin Chem Biol, 1998, 2(2): 222.
 
  [2]蒲琦, 李素贞, 李盼. 植物锌铁转运蛋白ZIP基因家族的研究进展[J]. 生物技术通报, 2012(10):15.
 
  [3]肖家欣, 齐笑笑, 张绍玲. 锌和铁缺乏对枳生理指标、矿物质含量及叶片超微结构的影响[J]. 应用生态学学报, 2010, 21(8): 1974.
 
  [4]Guerinot M L. The ZIP family of metal transporters [J]. BBA-Biomembranes, 2000, 1465(1/2): 190.   [5]Grotz N, Fox T, Connolly E L, et al. Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:7220.
 
  [6]López-Millán A, Ellis D R, Grusak M A. Identification and characterization of several new members of the ZIP family of metal ion transporters in Medicago truncatula[J]. Plant Mol Biol, 2004, 54: 583.

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