牛乳铁蛋白在乳球菌中的应用

来源：中文期刊网位置：医药卫生时间：13-05-28 09:03

重组乳酸乳球菌表达载体的构建pJ201-LFcinBA载体质粒和pAMJ399载体质粒经双酶切、胶回收的方法获得相应的片段，经T4DNA连接酶的作用下16℃过夜后，电转化乳酸乳球菌MG1363中，电转的电压为2.5kV，转化子涂布于GM17(含有红霉素1μg/mL)固体培养基中，32℃厌氧培养20h，挑取菌落接种于GM17(含有红霉素1μg/mL)液体培养基中，32℃厌氧培养过夜后，提取质粒鉴定。将获得的重组乳酸乳球菌命名为pAMJ399-LFcinBA/MG1363。重组蛋白表达条件的优化为了获得重组蛋白表达的适宜pH和生长条件，在乳酸菌生长的GM17培养基中分别添加1.9%、2.85%、3.8%、4.75%和5.7%的β-甘油磷酸二钠，在培养10h后测定重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcin-BA/MG1363在生长过程中OD600值和pH值，确定β-甘油磷酸二钠对重组乳酸乳球菌生长的pH和OD600值的影响。目的基因在乳酸乳球菌中的诱导表达挑取阳性重组菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363单菌落接种于含有3.8%的β-甘油磷酸二钠的GM17(含有红霉素1μg/mL)液体培养基中，32℃厌氧培养20h，按1∶50的比例进行扩大培养20h，终止培养。上清通过TCA的方法进行10倍浓缩，沉淀用溶菌酶进行处理，将处理好的上清和沉淀与2×SDS加样缓冲液混合后煮沸10min，经12000r/min离心3min，取20μL上样，以蛋白质标准分子量为参考，采用Tricine-SDS-PAGE进行电泳分析，并以同样培养和处理的pAMJ399/MG1363乳酸乳球菌作为对照。免疫印迹(Western-blot)鉴定Tricine-SDS-PAGE结束后，将凝胶中的蛋白经湿转转印仪转印至经甲醇平衡的PVDF膜上，恒压100V转印120min。转印结束后将PVDF膜浸于5%脱脂乳溶液中进行封闭，4℃过夜，PBST洗去脱脂乳，用Myc小鼠源单克隆抗体作为第一抗体稀释比例为1∶300，作用2h，辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG作为第二抗体稀释比例为1∶2000，作用2h，ECL显色检测。

结果

目的片段和表达载体的获取质粒pJ201-LFcinBA和pAMJ399进行SalⅠ、BglⅡ双酶切，胶回收得到带有黏性末端的目的基因片段LFcinBA和载体pAMJ399，大小分别为355bp和6947bp，然后通过0.8%的琼脂糖凝胶核电泳分析，回收的目的基因片段LFcinBA和表达载体pAMJ399片段经鉴定正确。重组乳酸乳球菌表达载体的构建将构建的质粒pAMJ399-LFcinBA经SalⅠ和BglⅡ双酶切分别得到约350bp的目的基因片段和7000bp的载体片段(见图2)，表明获得含有重组质粒pAMJ399-LFcinBA的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。重组蛋白表达条件的优化在GM17培养基中分别添加1.9%、2.85%、3.8%、4.75%和5.7%的β-甘油磷酸二钠，结果可见添加不同浓度的β-甘油磷酸二钠对重组菌的OD600值在测定的时间内没有发生明显的变化，见图3;同时可见添加3.8%的β-甘油磷酸二钠能够使重组乳酸乳球菌在培养后的10～24h内pH值维持在5.5～6.5之间，从而满足表达载体质粒pAMJ399的启动子P170的重组蛋白表达条件。重组乳酸乳球菌的诱导表达鉴定重组菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363经Tricine-SDS-PAGE和Western-blot分析后结果表明，在重组菌的上清中约13ku处出现了特异的蛋白反应带，见图5，表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中以分泌形式获得了表达，且Lfampin的重组蛋白可能是以三聚体的形式存在。

讨论

在加入1.9%的β-甘油磷酸二钠GM17培养基中，培养10h后的pH在4.5～5.0之间，不能够启动P170启动子，通过在GM17培养基中添加不同浓度的β-甘油磷酸二钠，确定添加3.8%的β-甘油磷酸二钠能够使重组乳酸乳球菌在培养后的10～24h内pH值维持在5.5～6.5，并且能够使菌体的浓度维持在良好的生长状态。牛乳铁蛋白肽LFcinB和LFampin基因在重组乳酸乳球菌中是分别表达的，在优化设计时在两端基因之间加入了终止密码子、RBS序列和分泌表达的信号肽序列，理论上将获得分别表达的两端蛋白约为ku的LfcinB和4.3ku的Lfampin，通过myc小鼠源单克隆抗体可检测到Lfampin重组蛋白，由于检测到的蛋白大小约为13ku，表明Lfampin重组蛋白在表达后形成了三聚体，这可能与Lfampin的氨基酸序列结构二硫键有关［16］。乳酸乳球菌作为表达和传递外源基因的载体系统具有益生性、安全性，以及可通过先天性免疫激活肠道黏膜免疫系统，不会刺激机体产生抗体等重要特点，尤其是分泌型载体表达的外源蛋白无需纯化，近年来受到越来越多的重视。构建重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA的意义在于重组乳酸乳球菌表达产物不需要纯化、复性等过程，直接可以应用到生产实践中。基于乳酸乳球菌和牛乳铁蛋白肽的优点，将两段密码子优化的牛乳铁蛋白肽在乳酸乳球菌中共表达，使其将来能够作为饲料添加剂更好地应用到实际生产中，为畜牧业生产服务。

作者：孟庆森 姜艳平 崔文 李海滨 乔薪瑗 葛俊伟 李一经 唐丽杰 单位：东北大学生命学院